Полимеразната верижна реакция представлява процедура от молекулярната биология, която дублира участъци от генетичен материал (Дезоксирибонуклеинова киселина, ДНК). Милиони идентични копия се произвеждат от малки количества ДНК. По този начин са налични количества, които са достатъчни за различни разследвания.
Какво представлява полимеразната верижна реакция?
Полимеразната верижна реакция представлява метод от молекулярната биология, който дублира участъци от генетичен материал (Дезоксирибонуклеинова киселина, ДНК). Терминът полимеразна верижна реакция (PCR) описва in vitro (латински: в стъклото) реакция с помощта на ензим, полимеразата (ДНК полимераза), което води до дублиране на определени ген последователности. Продуктът на реакцията е и изходният материал за нов цикъл на тази реакция. Броят на молекули се удвоява и в същото време служи като шаблон за нов цикъл. Това се нарича експоненциално умножение. Провежда се в лабораторията с голяма скорост от няколко минути, подобно на верижна реакция. Този лабораторен процес имитира дублирането на генетична информация (ДНК), което се случва при естествени условия по време на репликацията. Американският химик KB Mullis се счита за откривател на този процес. През 1983 г. той въвежда този процес на синтез на ДНК и десет години по-късно е отличен с Нобелова награда за химия.
Функция, ефект и цели
В живите организми ДНК в хромозоми има дължина, която не може да бъде амплифицирана с помощта на PCR. Вместо това се прилага за усилване на определен раздел. Това могат да бъдат гени, специфична част от a ген, или региони, които не са транскрибирани в протеини, т.е. не са кодирани. Тези раздели обикновено включват не повече от три хиляди базови двойки, в сравнение с приблизително два пъти три милиарда базови двойки на набор от хромозоми при хората. Полимеразната верижна реакция изисква едно- или двуверижна ДНК верига, чиято структура трябва да бъде поне частично известна. В допълнение към ензима, полимеразата, се използват два праймера. Това са градивни елементи на ДНК, които действат като начална и крайна точка. Те се характеризират с последователност, която точно съвпада с региона, който трябва да бъде усилен. В лабораторията полимеразната верижна реакция се извършва в програмируем нагревателен блок. Необходимите компоненти като полимераза, грунд, градивните елементи за изграждане на новата верига (дезоксирибонуклеозидни трифосфати) и магнезий йони се добавят заедно в буферен разтвор. Програмата температура-време за реакцията започва с денатурация при температура над 94 ° C. В този процес двуверижната ДНК се разцепва и присъства в едноверижна форма. В следващия етап, при около 70 ° C, грундът е свързан с ген последователност и формира начална точка за ензимната реакция. Оттук нататък полимеразата синтезира комплементарната верига. След това започва нов цикъл, отново състоящ се от трите етапа на денатурация, праймерно свързване и синтез на ДНК веригата. Полимеразната верижна реакция се използва в съдебната медицина, клиничната диагностика и клиничните изследвания. В съдебната наука се извлича ДНК кожа, слюнка, коса, сперма или кръв от местопрестъпления и след усилване се сравнява с известни проби и се използва за идентифициране на конкретни лица. Използвайки този генетичен пръстов отпечатък, бащинството също може да бъде изяснено с модифициран подход. При изясняването на болестите полимеразната верижна реакция се използва за проверка на участващите гени. Някои бактериални заболявания могат да бъдат класифицирани чрез разпознаване на специфични последователности. Вирусните заболявания могат да се характеризират, когато вирусната ДНК или РНК се трансформира и усили. В кръв скрининг, е възможно да се открие хепатит или медиирани от ХИВ заболявания в много ранен стадий. При диагностика на тумори се използва за идентифициране на туморни клетки. Това дава възможност да се класифицира туморът, да се оцени хода на заболяването, успеха на притежава и прогнозата. В изследванията полимеразната верижна реакция се използва за идентифициране на гени, свързани с различни заболявания.За клониране на гени, което не е същото като клониране на организъм, генът се усилва, преди да бъде прехвърлен към други организми във вектор (латински: пътешественик, носител ). Те могат да действат като модели за по-добро изучаване на болестта или за нейното производство протеини които могат да се използват като наркотици.
Рискове и опасности
Полимеразната верижна реакция има огромен потенциал за откриване на малки количества ДНК. За да се възползвате от множеството възможности и да се предпазите от важни грешки, трябва да се вземат предвид определени предпоставки и различни източници на грешки. Могат да бъдат усилени само части от генетичния материал, чиято последователност е поне частично известна. Напълно неизвестни последователности не могат да бъдат усилени по този метод. Продуктите на усилването могат да бъдат визуализирани след това. Ако очакваният сигнал не се вижда, въпреки че търсената последователност е налице, има фалшиво отрицателен резултат. Най-често това е резултат от неоптимизирани или лошо оптимизирани условия на реакция. Те трябва да бъдат определени като функция от целевата последователност. За тази цел се тестват различни температурни и времеви профили, последователности на праймери и количества, както и концентрации на други вещества в реакционната смес. Фалшиво положителните резултати се показват като сигнали, които не могат да бъдат присвоени на желания продукт. Основните проблеми са причинени от замърсявания с ДНК, произхождащи от изследователя или от източник, различен от този, който трябва да се анализира. ДНК с бактериален произход също влияе върху резултата от полимеразна верижна реакция. Чрез носене на ръкавици и полагането на големи грижи могат да се предотвратят такива грешки и да се формулират надеждни заключения за усилените продукти.
