Моля, обърнете внимание: Следната статия е включена в други конвенционални терапии, тъй като все още не е наличен отделен раздел за експериментални методи на молекулярна биология извън хуманната медицина. Методът CRISPR / Cas е молекулярно-биологичен метод за целенасочено рязане, както и модификация на ДНК (редактиране на геном; ген ножици). През 1987 г. учените откриха незабелязан по-рано адаптатор имунната система в Е. coli. Това се основава на така наречените CRPSPR последователности (клъстерирани редовно разпръснати къси палиндромни повторения) в ДНК. Е. coli интегрира ДНК на бактериофаги (групи от вируси които са специализирани в бактерии като клетки гостоприемници) CRSPR последователността на собствената си ДНК, като по този начин транскрибира crRNA (пренаписване на ДНК в РНК). CrRNA се състои както от дистанционни, така и от повторни последователности. Разделителни последователности са последователностите, „извлечени“ от бактерии. Така наречената trRNA (tracrRNA) се свързва с посочени повторни последователности. Той набира CAS9 ензима. Сега присъства комплекс - crRNA: tracrRNA: Cas9 комплекс - който е способен да свързва ДНК на бактериофаги, комплементарен на космическите последователности на crRNA. Като така наречена ендонуклеаза (ДНК-режещ ензим, следователно рестрикционен ензим), CAS9 реже вирусната ДНК по двуверижен начин, което в крайна сметка води до невъзможност за репликация (т.е. без по-нататъшна репликация и следователно без по-нататъшна интеграция). Повече от десетилетие тази процедура се използва с акцент в изследванията за редактиране на генома. Описаното „crRNA: tracrRNA: Cas9 комплекс“ е универсално приложимо за растения и животни и позволява отстраняване (заличаване) и крайно заглушаване на гените. Използване извън научните изследвания е установено за повече от 5 години в земеделието и хранителните култури за толерантност към суша, както и подобряване на имунизацията срещу вирусни патогени. Процедурата може да се използва по-късно в хуманната медицина. От 2020 г. за първи път има лечебен терапевтичен подход за заболяване с вродено сърце дефект (витиум) при деца. Витиумът е част от сложното наследствено заболяване Noonan синдром (автозомно рецесивно или автозомно доминиращо наследство). След дешифриране на причинно-следствените варианти на LZTR1 ген, подходяща генна корекция на генерираните индуцирани плюрипотентни кардиомиоцити (сърце мускулни клетки) от стволови клетки на близнаците. The ген регулира основни сигнални пътища за клетъчна диференциация и растеж.
Преди тази потенциална терапия в хуманната медицина
Молекулярно генетично тестване за наследствени нарушения при родители, включително цялостно генетично консултиране.
Процедурата
Процедурата е подобна на тази на защитния механизъм на Е. coli, описана в имунната система. В този процес разделителната част на crRNA може да бъде модифицирана, за да се изреже специфична за последователността двойно-верижна комплементарна ДНК, което води до целеви делеции. Химически модифицираната trRNA: crRNA молекула се нарича guideRNA. Това изисква две различни crRNA: tracrRNA: Cas9 комплекси, за да се прикрепят към две места в ДНК. След отстраняване на ДНК фрагмента, свързана с ензими връзка на 2-ри ДНК фрагменти се осъществява чрез лигази. Това се различава от простото изрязване на ДНК последователност, както при бактерията. През годините са добавени основни техники за моделиране. Те позволяват не само делеции в ДНК веригата, но и добавяне (вмъкване) на нови ДНК нуклеотиди. Най-обещаващата модификация е основното редактиране. Тук делецията и по този начин отстраняването на ДНК фрагмент е последвано от вмъкването на нов ДНК фрагмент. Така наречената pegRNA (главен редактор на РНК) е достъпна тук като транскрипт на ДНК, която трябва да бъде вмъкната. С помощта на обратна транскриптаза, pegRNA се транскрибира в ДНК и се включва в ДНК, отново използвайки лигази. Протеинът CAS9, необходим за този процес, генерира едноверижни вместо двуверижни съкращения. Това позволява новият ДНК фрагмент да бъде вмъкнат с точно прилягане в нарязаната ДНК верига с изпъкналите си краища. Новата модификация е от основно значение за обмен на „патологичната“ ДНК последователност според „непатологичната“ в бъдеще в контекста на наследствено заболяване.
След терапия
За пореден път се извършва скрининг на геном, за да се потвърди успехът на редактирането на генома.
Възможни усложнения
Поради възможни базови несъответствия на guideRNA, могат да възникнат нецелеви ефекти, т.е. свързване на нежеланото място. Те могат да причинят точкови мутации (основни промени), вмъквания (включване на допълнителни нуклеотиди или ДНК последователности в ДНК последователност), делеции (загуба на ...), транслокации (промяна в позицията на ДНК) и инверсии (наличие на ДНК сегмент, обърнат 180 градуса). Ензимът CAS9 не намалява на желаното място във всеки случай. Увеличаването на специфичността обаче вече е реализирано чрез промени в протеиновия дизайн. Също така, чрез свързване на CAS9 с ендонуклеаза Fokl, също получена от бактерии, специфичността може да бъде увеличена до 1: 10,000 1 (без други модификации, само специфичност до 2: XNUMX).
