Клинично самостоятелно, т.е. на базата на сифилис симптоми, диагнозата не може да бъде поставена, тъй като симптоми на сифилис могат да варират значително и не са конкретни. Следователно микроскопични и серологични сифилис трябва да се направи тест. Не е възможно да се култивира бактерията T. pallidum върху хранителна среда. В микроскопската диагноза на сифилис тест, взема се намазка от измененията на кожата и лигавицата и полученият секрет се изследва под микроскоп с тъмно поле. Под нормален светлинен микроскоп бактерии не могат да бъдат открити, защото са твърде тънки. В допълнение към типичната структура, малък диаметър, равномерни намотки, бързото огъване и разтягане характерно е движение в средата на бактериалното тяло. Положителният резултат от теста е доказателство за заболяването, но отрицателният резултат не изключва сифилис. При серологичната диагностика се провеждат скринингови тестове за антитела, които са положителни 2-4 седмици след инфекцията. Антитела се откриват, които са се образували срещу антигени на повърхността на патогена бактерии. Тестът TPHA (тест за хемаглутинация на T. pallidum, днес наричан още TPPA тест) е чувствителна и силно специфична реакция на търсене, при която антитела срещу T. pallidum бучка (аглутинати) червено кръв клетки (еритроцити) заредена с антиген на T. pallidum. Той става положителен през втората седмица след заразяване със сифилис и остава такъв в продължение на много години след излекуването на болестта („серонар“). В ранния първичен стадий той все още може да бъде отрицателен. Тестът се използва в случаи на съмнение за сифилис, но също така и за рутинен скрининг в ранна бременност, Or кръв донори и кръвни консерви. Положителните резултати изискват тест за потвърждение: В теста FTA-ABS (Тест за абсорбция на антитяло на флуоресценция Treponema) бактерии се фиксират върху пързалка и се събират заедно с кръв серум, течната част на кръвта. The антитела в кръвния серум след това се прикрепят към антигените на бактериите. След изплакване на серума антителата отново се маркират с други антитела, носещи флуоресцентна боя. По този начин под флуоресцентния микроскоп антителата, търсени срещу бактериите, стават видими. Тестът FTA-ABS, подобно на TPPH теста, е положителен през втората седмица след инфекцията и остава положителен в смисъла на серонен белег години след клинично излекуване. Тестът VDRL (лабораторен тест за венерическа болест), известен също като кардиолипинов флокулационен тест, се използва за терапия и напредък мониторинг. Този тест за сифилис се използва за откриване на липид-специфични антитела, които отстъпват, докато кожните прояви зарастват. Кардиолипинът е антиген, извлечен от сърце на говеда и обвързани с холестерол частици. Натоварените частици се събират заедно със серума на пациента. В положителния случай настъпва флокулация (аглутинация). Този тест става положителен 4-6 седмици след инфекцията или 1-3 седмици след появата на основния ефект. Количеството на липид-специфичните антитела бързо намалява, тъй като външните симптоми на сифилис се лекуват и вече не са налице след успешно лечение. Това количество (титър) може да се използва за оценка дали терапията е била успешна или сифилисът е бил недостатъчно лекуван. Тестът VDRL обаче може да бъде положителен и за други заболявания, така че е характерен за сифилис, но не е специфичен за него. Извършва се CSF тест за потвърждаване на невросифилиса при пациенти с неврологични симптоми на сифилис и за откриване или изключване на асимптоматичен невросифилис. Само антитела в CSF, които също са произведени в ЦНС, доказват невросифилис, но не и антитела, които са мигрирали от серума в CSF. Това може да се определи чрез сравняване на титрите на антителата в ликвора и серума. Ако съотношението на титъра на CSF към серумния титър надвишава 2, се подозира невросифилис. Сифилисът може да се прояви по много различни начини, особено симптоми на кожата може да бъде много различно: „Сифилисът е маймуната сред кожните заболявания“, т.е. може да фалшифицира почти всяка кожна болест. Понякога Roseola syphilitica се бърка с лекарствен екзантем, което е резултат от непоносимост към наркотици. Болезненото язва molle, причинени от бактерията H. ducreyi и други кожни промени причинени от инфекции (напр гранулом venerum) трябва да се различава от язва твърда.
