Техниката на кръпка-скоба е името, дадено на електрофизиологична техника на измерване. Позволява йонните токове да се измерват през отделни канали в плазмената мембрана.
Какво представлява техниката за закрепване?
Техниката на пластирната скоба или методът на пластирната скоба принадлежи на електрофизиологията, която е клон на неврофизиологията, занимаваща се с електрохимичното предаване на сигнали в нервната система. С помощта на този метод е възможно да се визуализират отделни йонни канали в клетъчната мембрана на телесна клетка. Това включва измерване на токове на няколко пикоампера. Техниката за закрепване на кръпка е описана за първи път през 1976 г. от немския биофизик Ервин Нехер и германския лекар Берт Сакман. Двамата учени са удостоени с Нобелова награда за физиология или медицина през 1991 г. за развитието на техниката на скобата. По този начин електрофизиологичните изследвания бяха на практика революционизирани от техниката на пластирната скоба, защото отвориха възможността за наблюдение на електрическото поведение на мембраната протеини на отделни молекули. Терминът patch идва от английския език и означава „кръпка“. Отнася се за малка мембранна секция под пластирната пипета, която се използва като измервателен електрод. По време на процеса на измерване, мембранният пластир е фиксиран или затегнат (за затягане) до определени потенциали.
Функция, ефект и цели
Техниката на пластир-скоба е електрофизиологичен метод за анализ. Тя се основава на биологичния факт, че клетките имат голям брой пори и йонни канали. Различни концентрации или заряди на йони възникват във и извън всяка клетка, което зависи от физиологичното състояние на клетката. Липидният двуслой на мембраната не е пропусклив вода молекули както и йони. Независимо от това, обменът на заредени частици се извършва по целия клетъчната мембрана на неравномерни интервали. Причината за това е зависимостта на напрежението на йонните канали. Ако се достигне определен мембранен потенциал, каналите се отварят съгласно принципа „всичко или нищо“. Точно тук се появява техниката на пластирната скоба. По този начин измервателната пипета се придвижва към йонния канал, без да прониква през клетъчната мембрана. По този начин локалният електрически потенциал може да бъде точно определен. Токовете на изтичане, които биха могли да повлияят на резултата от измерването, обикновено могат да бъдат избегнати чрез електрически изключително плътни връзки между ръба на пипетата и клетъчната мембрана. Методът за закрепваща скоба се основава на техниката за захващане на напрежението. Тази техника е разработена през 1930-те години от американския биофизик Кенет Стюарт Коул (1900-1984) за измерване на токове върху нервните клетки, които са непокътнати. В клемата за напрежение, поставянето на два електрода в клетка се извършва, за да се осигури командно или задържащо напрежение. В същото време се използва друг електрод за записване на токовете, възникващи през мембраната. Ако неврофизиолозите искат да знаят за протичането на електрически токове през специфични области на a нервна клетка мембрана, те използват техниката на скобата. За целта те използват фина стъклена пипета, която се поставя от външната страна на клетката. Отрицателно налягане може да се създаде чрез аспириране с помощта на хиподермична спринцовка. Тази процедура кара мембраната леко да се издуе на съответното място. Отрицателното налягане гарантира, че стъклото е прикрепено към мембраната. Това води до електрическа изолация на малкото мембранно петно в пипетата от останалата част на мембраната. За да измерват електрическите токове, неврофизиолозите използват усилвател с пластир. Това е специално измервателно устройство. В идеалния случай ученият може да използва устройството, за да получи информация за електрическите свойства на отделните йонни канали. Йонните канали регулират например притока и изтичането на натрий йони, които са заредени положително, в нервните клетки. Разследването се провежда върху клетките на хора, растения или животни. Методът за закрепване на скоби обикновено се извършва в измервателна станция, която включва различни устройства. На измервателната маса, заглушена от вибрации, има така наречената клетка на Фарадей, която служи като електрически щит. Освен това е на разположение оптичен микроскоп, включващ микроманипулатор, за да постави пластирната пипета на място. Освен това държачът на пипетата има връзка с предусилвател, докато държачът на пробата е свързан към електрод за баня. Усилвателят на пластирната скоба функционира за усилване на сигнала на предусилвателя. Предвиден е и монитор за наблюдение на DUT, както и на пипетата за пластир. В повечето случаи на измервателната маса се предлагат компютър и няколко устройства за съхранение на данни, за да се даде възможност за цифров запис.
Рискове, странични ефекти и опасности
Няма рискове, свързани с техниката на пластир-скоба. Например, клетки от хора, животни или растения се изследват едва след като бъдат отстранени. Рядко съществува неограничен достъп до външната клетъчна мембрана. Поради тази причина често е необходимо клетките да се подготвят за метода на скобата. След напълване на пластирната пипета, тя се затяга в микроманипулатор. Това е свързано с усилвателя на пластирната скоба и внимателно натиснато върху непокътната клетка. Процесът може да бъде проследен с монитор или микроскоп. Под пипетата седи парче мембрана, наречено мембранен пластир. Лекото отрицателно налягане, създадено в задния край на пипетата, осигурява силна връзка между пипетата и мембраната. Този процес води до създаване на електрическо съпротивление между външния разтвор и вътрешността на пипетата на няколко гигаома. Учените също се позовават на това като „гигаза“, което позволява да се постигне прикрепена към клетките конфигурация на метода на скобата. Токът, протичащ през йонния канал в пластира, протича и през съдържанието на пипетата поради голямото съпротивление на гигаза. Електрод, свързан към усилвателя, се потапя в разтвора на пипетата, което позволява да се измерват дейностите на отделни йонни канали в пластирната мембрана.
