Какво е PCR тест?
PCR тестът е лабораторен метод, използван в молекулярната биология и медицина. Тестът се използва за директно откриване – и характеризиране – на генетичен материал. PCR методът се счита от експертите за лесен за изпълнение, универсално приложим и стабилен.
В лабораторията PCR тестът се състои от две стъпки. В първия етап съществуващият генетичен материал се амплифицира с помощта на полимеразна верижна реакция (PCR). Това позволява да се изследват най-малките следи от ДНК. Това е и причината PCR тестовете да реагират толкова чувствително.
Във втора стъпка генетичният материал се разделя според неговите свойства, „сортира“ и по този начин се характеризира. С други думи, определя се фината структура на ДНК.
Има много възможни приложения: лекарите използват PCR тест, например за изследване на тампони за наличие на коронавируси, кръводаряване за ХИВ или за скрининг на новородени за възможни наследствени заболявания. Бактериалните инфекции – например с патогена на туберкулозата – или паразитните инфекции (малария) също могат да бъдат изяснени с PCR.
Те също така помагат за осъждането на извършителите в съдебната медицина въз основа на техните генетични отпечатъци или се използват като тестове за бащинство.
Колко дълго е валиден PCR тест?
Резултатът от PCR тест обикновено е валиден 48 часа от момента на вземане на пробата.
Колко надежден е PCR тестът?
PCR е изпитан и тестван метод за откриване в молекулярната диагностика и медицина. Счита се за така наречения златен стандарт с много нисък процент грешки. Тестовете се характеризират по-специално с много висока чувствителност и специфичност.
Чувствителността означава надеждността, с която тестът открива генетичния материал, който трябва да бъде открит.
Специфичност означава сигурността, с която тестът определя, че въпросният генетичен материал не присъства в пробата.
Кога PCR тестовете работят за инфекция със Sars-CoV-2?
По правило PCR тестът открива корона инфекция два до три дни преди и до 20 дни след появата на симптомите. Дори при заразени хора, които остават напълно без симптоми, тестът е ефективен в критичен времеви прозорец, когато те могат да заразят други.
В отделни случаи откриването е възможно дори 60 дни след появата на симптомите.
Възможни източници на грешка
Процентът грешки в процеса на копиране на ДНК е незначителен на практика. Въпреки че ДНК полимеразите никога не са без грешки, те почти не играят роля в процедурата за PCR тест.
На практика потенциалните източници на грешки се крият по-скоро във вземането на проби: следователно е важно обучени медицински специалисти да извършват натривките. Пробите от слюнка и гаргара биха могли евентуално да намалят точността на теста, тъй като тук възникват ефекти на разреждане.
Как работи PCR тестът?
PCR тестът се извършва например от семеен лекар или в специални тестови центрове. Първо, лекари или обучени медицински специалисти вземат проба. За теста обикновено се взема тампон от горните дихателни пътища. Това обикновено е под формата на тампон от устата или назофаринкса.
Възможна е и гаргара с разтвор за изплакване. Кръвната проба е нетипична за откриване на корона – но широко използвана при скрининг на новородени например.
Независимо от вида на взетата проба, генетичният материал се открива върху памучния тампон, в разтвора за изплакване или в капката кръв. Този пробен материал се изпраща в лаборатория, където се изолира и пречиства.
След това PCR тестът се разделя на две стъпки:
- PCR: В тази стъпка количеството на първоначалния генетичен материал се усилва.
Стъпка 1: PCR – „Полимеразна верижна реакция“
„PCR“ е първата от две стъпки: Това е мястото, където количеството налична изходна ДНК се усилва. Това е така, защото генетичният материал може да бъде анализиран само след като е наличен в достатъчни количества. В повечето случаи това е човешка ДНК; в случай на тестове за коронавирус, това е вирусна РНК.
Съкращението PCR означава "полимеразна верижна реакция".
Какво е необходимо за PCR?
Изходната ДНК се поставя в реакционен съд със специални вещества. Съществуващият генетичен материал служи като шаблон, който се копира в присъствието на определени ензими (Taq полимераза) и определени основни ДНК градивни елементи.
Процесът на копиране се извършва в няколко повтарящи се цикъла.
По-конкретно, следните вещества се добавят заедно:
- Начална ДНК: Проба от материал, който трябва да бъде копиран.
- Основни градивни елементи на ДНК: Това са нуклеобазите аденин, тимин, цитозин и гуанин.
- ДНК полимераза: Ензим, който свързва отделни ДНК градивни блокове, за да образува добре дефинирана ДНК верига. Новополучената нишка е огледален образ (комплементарна) на оригиналния изходен материал.
- Праймери: Състоят се от 16 до 24 базови двойки и служат като начална позиция и стартов сигнал. Праймерите показват на ДНК полимеразата на коя позиция (на изходната ДНК) започва процесът на копиране.
Как се провежда PCR тест?
Сега, когато всички вещества, необходими за PCR, присъстват в реакционния съд, действителният процес на копиране на генетичния материал може да започне. Това се стартира, контролира и спира отново единствено от температурата.
Следователно реакционният съд се нагрява или охлажда до различни температури една след друга. Това се прави с помощта на специално устройство, известно като термоциклер. Цялата реакция отнема около един до два часа.
Отделните стъпки на един PCR цикъл са
- Денатуриране на двойните вериги на ДНК: Пробата се нагрява до около 90 градуса по Целзий. Това разделя оригиналната двойна верига на ДНК на две отделни (комплементарни) единични вериги.
- Закрепване на грундовете: Температурата се понижава до малко под 60 градуса по Целзий. Това кара праймерите (прав праймер, обратен праймер) да се прикрепят към определени позиции на съответните отделни ДНК вериги.
След завършен цикъл температурата отново се повишава до около 90 градуса по Целзий – цикълът започва отново отначало.
PCR методът може да се използва за амплифициране на ДНК последователности до около три килобазови двойки (kbp). Това съответства на около 3,000 основни ДНК градивни блока, свързани заедно, за да образуват „верига“. За сравнение: човешкият геном съхранява плановете и информацията за функционирането на клетката в около три милиарда базови двойки – геномът на коронавируса, от друга страна, се състои от 30,000 XNUMX базови двойки. Следователно PCR тест може да амплифицира и изследва само кратки участъци от общата ДНК.
Грундовете са от решаващо значение
Изборът на праймери е от решаващо значение за PCR процедурата. При диагностиката на Sars-CoV-2 например се използват няколко праймера (мултиплексна PCR).
Corona PCR тестовете по този начин търсят три различни вирусни гена: Това повишава общата специфичност до почти 99.99%. Това означава, че при този висок процент на попадение има само един фалшиво положителен тест на 10,000 XNUMX теста (ако пробите са взети правилно).
Колко копиран генетичен материал е наличен сега?
Нека приемем, че две идентични двойни вериги на ДНК присъстват след първия цикъл.
След всеки цикъл количеството (копиран) генетичен материал се удвоява. Следователно количеството на ДНК нараства експоненциално.
Лекарите обикновено повтарят този процес около двадесет до тридесет пъти.
Образно казано, това означава, че дори в началото в пробата да се открие само една двойна верига на ДНК, след двадесет цикъла в реакционния съд вече има милион идентични копия.
Какво означава стойността на Ct?
Броят на изпълнените PCR цикли е посочен под формата на така наречената Ct стойност. “Ct” произлиза от английския термин “cycle threshold”. Тази стойност на Ct дава възможност да се направят изявления за количеството генетичен материал, който се търси.
При ниска стойност на Ct от 20 има много изходен генетичен материал. Въпреки това, ако стойността на Ct е висока – около 30 цикъла – има съответно малко ДНК. Следователно PCR цикълът трябва да се провежда по-често.
Стъпка 2: Електрофореза „Сортиране по размер“
След като е наличен достатъчно „обогатен“ генетичен материал, може да се извърши електрофореза. В този процес учените използват специфично свойство на ДНК: нейния електрически заряд.
Индивидуалните градивни елементи на ДНК са свързани помежду си чрез (отрицателно) зареден захарно-фосфатен гръбнак. Колкото по-дълга е определена ДНК последователност, толкова по-висок е нейният електрически заряд.
Това позволява генетичният материал да бъде изследван и характеризиран. На практика неизвестна проба обикновено се начертава срещу известна референция на „стартова линия“ и се сравнява една с друга след определен период от време.
Ако „скоростта на миграция“ е една и съща за двете последователности, това означава, че откриването най-вероятно е положително: Откриването е много вероятно положително – генът, който търсите, се съдържа в пробата.
Специален случай на коронавирус: подготовка на пробата и RT-PCR
Откриването на коронавирус е специален случай. Sars-CoV-2 е един от така наречените РНК вируси. Това означава, че генетичният материал на Sars-CoV-2 присъства под формата на РНК (рибонуклеинова киселина).
РНК се различава от ДНК само в няколко отношения. Освен всичко друго, той присъства като единична нишка и се основава на захарната рибоза вместо на 2'-дезоксирибозата. Нуклеобазата тимин също е заменена от урацил като четвърта база.
Тази вирусна РНК трябва да бъде „транскрибирана“ в ДНК преди редовен PCR тест. Този процес се нарича обратна транскрипция (RT) – оттук и терминът RT-PCR. Като част от този процес се получава единична верига сДНК („комплементарна ДНК“). В следваща стъпка единичната верига на кДНК се допълва от втора ДНК верига с огледален образ.
Колко време отнема да се получи резултатът?
След като пробата бъде изпратена в лабораторията, обикновено ще получите резултат в рамките на един или два работни дни. В тестовите центрове, които често изследват пробите директно на място, това може да отнеме само няколко часа. Времето зависи до голяма степен от съответния тестов център и неговата логистика.
Въпреки сложните работни процеси, съвременните лаборатории са в състояние да извършват PCR тестове с висока производителност. Специални автоматизирани устройства помагат за провеждането на тестовете.
Независимо от това, PCR тестът се счита за сравнително „бавен“, но много по-надежден метод за откриване.
Какво се случва, ако резултатът е положителен?
Ако пробата е взета правилно, положителен PCR тест означава, че има много голяма вероятност тестваното лице да е заразено със Sars-CoV-2.
Ако е потвърдено, че сте заразени с коронавирус чрез PCR тест, отделът за обществено здраве ще получи известие за положителния резултат от теста от съответната лаборатория. В такъв случай отделът за обществено здраве ще разпореди изолация или карантина.
Автоматично ли съм заразен, ако пробата ми е положителна за PCR?
Обикновено да. Но не винаги. Резултатът от PCR тест винаги трябва да се тълкува в контекста. Положителният тест означава преди всичко, че носите вирусен материал.
Понякога е полезен допълнителен тест за антитела
В такива случаи тестът за антитела осигурява сигурност, която потвърждава валидността на PCR теста. Най-добре е да обсъдите това с Вашия лекар. Те могат да ви помогнат да интерпретирате правилно резултата от PCR теста.
Какво да направите, ако резултатът е отрицателен?
Отрицателен резултат от PCR тест най-вероятно означава, че не сте имали Covid-19 по време на вземането на пробата и следователно в момента не сте инфекциозни. Възможно е обаче да сте в ранна фаза на инфекция.
Корона инфекциите обикновено могат да бъдат открити едва на втория или третия ден след заразяването. Следователно резултатът не е безплатен пропуск. Затова трябва да продължите да спазвате правилата за социално дистанциране и хигиена и да продължите да носите маска FFP2 – за ваша собствена защита и тази на другите.
PCR тест за деца
PCR тестът за деца не се различава от PCR теста за възрастни. Както вземането на проби, така и интерпретацията на резултатите се отнасят както за деца, така и за възрастни.
Какви са рисковете от PCR тест?
PCR тестът не включва никакви физически рискове. Само вземането на проба от назофарингеален тампон се възприема от някои хора като обезпокоително или неприятно.
Колко струва един PCR тест?
Моля, обърнете внимание: Ако сте се тествали у дома и сте получили положителен резултат, трябва незабавно да си уговорите час при личния лекар по телефона. Вашият лекар ще обсъди следващите стъпки с вас по телефона.
Като алтернатива е най-добре да се обадите на телефон 116 117, за да се запишете за PCR тест. В идеалния случай трябва да останете вкъщи до теста за потвърждение, за да защитите себе си и другите.
